دکتر سید سلمان فاطمی

چالش کمبود اندام برای پیوند، آیا با پیوند بین گونه ای اندام های حیوانی قابل حل است؟

ریشه ی مشترک حیات در میان همه ی اجزای زنده ی زمین، سبب شده است دانشمندان به فکر پیوند اندام های حیوانی در انسان باشند. دو جراحی اخیر پیوند قلب و کبد خوک به انسان، نوید بخش موفقیت این پیوند در آینده‌ای نزدیک است.

مشکل اصلی، ایجاد پاسخ ایمنی در بدن فرد گیرنده است که به دلیل تفاوت های موجود بین بدن انسان و حیوان این پاسخ نسبتا شدید خواهد بود و باعث رد پیوند میشود. حتی در پیوندهای بین انسانی، اگر دو فرد گروه خون یکسان و آنتی ژن های تقریبا معادلی روی سلولهای خونی نداشته باشند، پیوند میتواند موفقیت آمیز نباشد.

از این رو تلاش ها امروز روی تغییر مصنوعی آنتی ژن های سطح سلول‌های خونی است تا عضو پیوندی با بدن گیرنده، سازگار شود.

این مداخله ی مصنوعی، در حقیقت نوعی تکامل یا evolution مصنوعی است که انسان با استفاده از پیشرفت های ژنتیکی و روش تغییر ژنها کریسپر انجام میدهد. قدرت انسان در تغییر ژنها و سطح سلول‌ها به زودی میتواند معادله ی درمانی بیماری های سختی مانند نارسایی اندام ها از جمله نارسایی کلیه و کبد و حتی سرطان ها را تغییر دهد.(به مقاله ی
سلول های CAR T: مهندسی سلول های ایمنی بیماران برای درمان سرطان آنهادراین کانالمراجعه شود)

بینش‌هایی در مورد پیوند بین گونه ای کبد خوک (Xenotransplantation)

در حال حاضر، کمبود کبد انسان برای پیوند در ایالات متحده چقدر است؟
در آمریکا بیش از 11000 بیمار در لیست انتظار پیوند کبد هستند. سال گذشته بیش از 2000 بیمار، قبل از پیوند به دلیل وخامت بالینی یا مرگ، از لیست حذف شدند.
مهمتر از همه، این اعداد فقط نشان دهنده ی بیمارانی است که برای پیوند در لیست قرار گرفتند. بسیاری از بیماران آنقدر بیمار هستند که نمی توانند کاندید پیوند باشند.

در مجموع، در آمریکا بیماری مزمن کبدی حدود 35000 مرگ در سال را نتیجه میشود. اگر اعضای بدن به شکلی نامحدود در دسترس بود، میشد از بسیاری از این مرگ‌ها جلوگیری کرد.

چرا خوک ها برای پیوند زنو در نظر گرفته می شوند؟دلیل اصلی پیوند بین دو گونه، کمبود اندام برای پیوند است. با اینکه پستانداران غیرانسانی از نظر ژنتیکی به انسان شباهت زیادی دارند، برآوردن تقاضای با اندام های آن حیوانات، غیرممکن است.

خوک ها اندازه، آناتومی و فیزیولوژی مشابهی با انسان دارند. همچنین، در دسترس بودن خوک‌، بسیار بیشتر از نخستی‌های غیرانسانی مانند شامپانزه و گوریل است، خوک‌ها سریع‌تر به بلوغ و اندازه ی انسان می‌رسند (در 6 ماهگی در مقابل 15 سال برای حداکثر اندازه 4 فوت 11 اینچ) و تعداد فرزندان بیشتری در هر زایمان دارند (10 در مقابل 1).

علاوه بر این، در پیوند خوکی خطر بسیار کمتری برای انتقال بیماری مشترک بین انسان و دام وجود دارد همه این عوامل در ترکیب با پیشرفت مهندسی ژنتیک، خوک ها را به گونه ای انتخابی برای پیوند بین گونه ای تبدیل می کند.

موانع ژنتیکی پیوند کبد خوک به انسان چیست؟

موانع ژنتیکی برای این پیوند وجود دارد. اولین مورد، وجود آنتی بادی های از پیش ساخته شده ی ضد خوک در انسان است- که منجر به رد فوق حاد و مرگ پیوند می شود.

ژن‌هایی- که عمدتاً مسئول این رد پیوند هستند -GGTA1،CMAH، وB4GalNT2- می‌توانند با کمک تکنیک (CRISPRs) پاک شوند. حفاظت اضافی را می توان با افزودن پروتئین های تنظیم کننده ی مکمل در انسان مانند CD55، CD46 و CD59 در پیوند اعطا کرد.
دومین مانع، ناسازگاری پروتئین ها و آنزیم های خوک با سیستم انسانی است. در حال حاضر، نتیجه اصلی این ناسازگاری، میکروآنژیوپاتی ترومبوتیک است که عمدتاً ناشی از عدم فعالیت ترومبومودولین خوک و عملکرد بیش از حد فاکتور فون ویلبراند خوک است که هر دو منجر به ترومبوز در رگ های کبد پیوندی می شود. با افزودن نسخه های انسانی این ژن ها، ممکن است مشکل تا حدی اصلاح شود.

آخرین مانع، رد تاخیری پیوند زنوگرافت است که مشابه رد سلولی در پیوند آلوژن است، اما بسیار قوی‌تر است و به عوامل سرکوب‌کننده ی ایمنی اضافی نیاز دارد که برخی از آنها توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) برای پیوند انسان تأیید نشده‌اند.

دستکاری آنتی ژن لکوسیت های خوکی (SLA) کلاس I و SLA کلاس II ممکن است مفید باشد. با این حال، اکثر محققان بر این باورند که پس از موفقیت اولیه پیوند خوک به انسان، این امر در مرحله ی بعدی اتفاق خواهد افتاد.(اخیرا نخستین مورد پیوند کبد خوک به انسان هم انجام شد)

سایر دستکاری های ژنی برای جلوگیری از پاسخ های سیستم ایمنی ذاتی مانند افزودن CD47 و HLAE انسان نیز می تواند به بهبود نتایج کمک کند.

ترومبوسیتوپنی بزرگی می تواند در اثر به درون کشیدن پلاکت ها روی سلول های اندوتلیال سینوسی کبد به طور خاص در کبد ایجاد شود. این را می توان با حذف یا پاک کردنASGR1به حداقل رساند .

دکتر سید سلمان فاطمی . نورولوژیست, [02/14/2024 12:18 ب.ظ]
چگونه می توان از CRISPR برای تغییرات ژنتیکی استفاده کرد؟CRISPRs را می توان برای حذف ژن ها یا ایجاد و درج ژن هدفمند برای ایجاد خوک های تراریخته استفاده کرد. اساسا، CRISPR ها آنزیم هایی هستند که می توانند توالی های از پیش تعیین شده DNA را بر اساس یک RNA راهنما پیدا کرده و برش دهند. دانشمندان ژن هایی را- که می خواهند پاک کنند- شناسایی می کنند و یک RNA راهنما می سازند که با توالی هدف، مطابقت دارد. RNA های راهنمای چندگانه را می توان در هر آزمایش ساخت، به این معنی که چندین ژن می توانند همزمان مختل شوند. آنزیم های CRISPR و RNA های راهنما به سلول ها (یا جنین ها) وارد می شوند تا DNA را در مکان های انتخاب شده، برش دهند.

وقتی DNA قطع می شود، دو اتفاق می تواند رخ دهد: یا سلول خود را کاملاً با استفاده از آلل دیگر به عنوان قالب، اصلاح می کند و هیچ تغییر ژنتیکی رخ نمی دهد، یا سلول با اضافه یا تفریق تصادفی نوکلئوتیدها خود را اصلاح می کند. در حالت دوم، ممکن است خوانش ژن به طور کامل مختل شود و ژن مختل و ناک اوت شود.

برای ایجاد یک درج ترانس ژنی هدفمند، یک قطعه DNA که هم تراریخته مورد نظر و هم ناحیه ای مشابه با محل مورد نظر را در خود دارد، می تواند علاوه بر CRISPR و RNA راهنما استفاده شود.

هنگامی که برش انجام می شود، توالی تکمیلی قطعه ی اضافی DNA، ممکن است به عنوان قالب برای اصلاح برش DNA استفاده شود. اگر این اتفاق بیفتد، ترانس ژن، در محل مورد نظر به عنوان بخشی از اصلاح سلول، یکپارچه می شود.

چگونه باید خوک ها را برای دستکاری ژنتیکی انتخاب کرد؟اندازه خوک، گروه خونی و وجود عفونت های درون زا باید در هنگام انتخاب خوک برای دستکاری ژنتیکی، در نظر گرفته شود. خوک های کوجک و مینیاتوری برای هماهنگی بهتر با اندازه ی اندام های انسانی، ایده آل در نظر گرفته می شوند. خوک هایی با گروه خون O باید انتخاب شوند.

همچنین، همه خوک ها دارای رتروویروس های درون زا هستند که در DNA آنها گنجانده شده است. سه نوع از این جایگزینی ها وجود دارد: PERV A، PERV B، و PERV C. همه خوک ها دارای PERV A و PERV B در مقادیر مختلف هستند، اما برخی خوک ها PERV C ندارند. در حالت ایده آل، خوک هایی- که مقادیر کمتری از PERV A و PERV B دارند یا فاقد PERV C هستند- باید انتخاب شود.

چه دستورالعمل‌ها یا مقرراتی در مورد پیوند بین گونه ای یا اصلاح ژن‌های خوک موجود است؟FDA توصیه های غیر الزام آور در وب سایت خود در مورد مراقبت از خوک ها برای پیوند بیگانه(زنو) دارد.

این توصیه ها شامل منشاء حیوانات، اسکان در مراکز عاری از میکروب، برنامه های پیشگیری از عفونت و غربالگری عوامل عفونی، اهمیت نگهداری سوابق تغذیه حیوانات برای حداقل 2 نسل قبل از استفاده در مطالعات بالینی، و قرنطینه است.

حیوانات به مدت حداقل 3 هفته قبل از برداشت سلول ها، بافت ها یا اندام ها برای پیوند بین گونه ای باید به طور کامل زیر نظر باشند. علاوه بر این، بافت ها و نمونه های حیوانی باید حداقل به مدت 50 سال برای ردیابی هر گونه منبع عفونت نگهداری شوند.

با توجه به تغییرات ژنتیکی، FDA توصیه می کند که پتانسیل بافت آزمایش شود تا منعکس کننده فعالیت بیولوژیکی مورد نظر باشد. این بسیار مهم است زیرا در حال حاضر تنوع گسترده ای در پروفایل های بیان تراریخته در سلول های مختلف یک حیوان وجود دارد که به طور بالقوه می تواند موضوعی برای تایید FDA باشد.

تا اینجا، به نظر می رسد بزرگترین مانع برای پیوند کبد خوک به انسان چیست؟با حل اولین مانع اصلی (رد فوق حاد)، مانع فعلی ترومبوسیتوپنی شدید ناشی از برداشت بیشتر پلاکت‌های انسان توسط سلول‌های کوپفر خوک و سلول‌های اندوتلیال سینوسی کبد است. پس از رفع این مانع، موانع دیگری ممکن است آشکار شوند.

چه تحقیقاتی در مورد پیوند خارجی کبد خوک به حیوانات دیگر (مثلاً پستانداران غیر انسانی) انجام شده است؟

چند کارآزمایی بالینی در مورد پیوند بین گونه ای کبد ارتوتوپیکی پستانداران خوک- انسان pig-tononhuman انجام شده است. بقا از 3 روز با پیوند کبد از خوک های اصلاح نشده در دهه 1960 تا 8 روز با اولین خوک تراریخته CD55 در سال 2000 تا 4 تا 7 روز با اولینخوک که در آنGGTA1 حذف شده بود در سال 2010‐ متغیر بود.
بقا زمانی شروع به بهبود کرد که تغییرات ژنتیکی با اقداماتی برای جلوگیری از میکروآنژیوپاتی ترومبوتیک و ترومبوسیتوپنی با تزریق مداوم کمپلکس کنسانتره پروترومبین انسانی و مهار هم تحریکی در ابتدا با بلاتاسپت (بقای 25 روزه) و بعداً با ضد CD40 (بقای 29 روزه) تکمیل شد.

وضعیت فعلی پیوند کبد خوک به انسان چگونه است؟
چون کبد بیش از 500 عملکرد حیاتی دارد، پیوند بین گونه ای این عضو بسیار پیچیده است، حتی بیشتر از پیوند خارجی کلیه یا قلب.

دکتر سید سلمان فاطمی . نورولوژیست, [02/14/2024 12:18 ب.ظ]
با این پیچیدگی و بقای محدود در آزمایشات پستانداران غیر انسانی، تحقیقات خوک به انسان عقب مانده است.
حتی با وجود اینکه کارهای زیادی باید انجام شود تا پیوند ارتوپیک خوک به انسان در نظر گرفته شود، پل زدن بیماران برای پیوند با پرفیوژن خارج بدنی کبد خوک extracorporeal pig liver perfusion به واقعیت نزدیک است. در سال 1999، 2 بیمار- که تحت پرفیوژن خارج بدنی با کبد خوک تراریخته (با پروتئین های تنظیم کننده مکمل انسانی CD55 و CD59) قرار گرفتند- با موفقیت پیوند آلوژن دریافت کردند. این یک کارآزمایی بسیار محدود بود، اما با دانش فعلی در مورد سرکوب سیستم ایمنی در پیوند خارجی، درمان‌های دارویی برای جلوگیری از میکروآنژیوپاتی ترومبوتیک و خوک‌های اصلاح‌شده ژنتیکی مدرن، آزمایش‌های مشابه دیگری می‌تواند به زودی به واقعیت تبدیل شود.

مهمترین گام های بعدی در تحقیق در این زمینه چیست؟مراحل بعدی رفع ترومبوسیتوپنی شدید و همچنین میکروآنژیوپاتی ترومبوتیک است. این مسائل با تغییرات ژنتیکی اضافی به حداقل رسیده است.

آیا تصورات نادرستی در جامعه گوارش و کبد در مورد این موضوع وجود دارد؟بله، این تصور غلط وجود دارد که همه خوک‌های تراریخته با تغییراتی در یک ژن، معادل هستند. خوک های مختلف از یک منبع دارای طیف گسترده ای از الگوهای بیان ژن هستند، برخی از آنها با حداقل بیان تکه تکه ی ژن مورد نظر هستند. از خوک‌های تراریخته گزارش شده است که بیان ژنی در 8 تا 96 درصد سلول‌های مثبت دارند و همه آنها دارای بیان تراریخته مثبت هستند. حتی موردی از پیوند کلیه به یک پستاندار غیر انسانی وجود داشت که در آن ژن مورد نظر بعداً مشخص شد که اصلاً در آن عضو خاص بیان نمی شود.

مستندسازی بیان تراریخته با ایمونوهیستوشیمی برای هر اندام و هر ترانس ژن باید به روش استاندارد برای تحقیقات پیوند بین گونه ای، تبدیل شود.
نگرانی در مورد بیان غیرقابل اطمینان ژن تراریخته به اندازه ای مهم است که برخی از کارشناسان معتقد به تولید چندین حیوان ناک اوت بدون بیان تراریخته برای آزمایشات بالینی هستند. توصیه‌های FDA برای شیوه‌های تولید خوب، مستلزم تعیین قدرت محصول xenotransplant است که نشان داده شده است در حال حاضر بسیار دشوار است زیرا بیان از حیوانی به حیوان دیگر (حتی با ژنوتیپ های یکسان) و حتی کاهش بیان در طول عمر حیوان وجود دارد.
به دلیل اهمیت این موضوع، گروه پژوهش در حال حاضر در حال بررسی روش های جدید برای دستیابی به بیان ژن ثابت و قابل اعتماد در همه اندام ها است.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9053494/